Sprog :
[wml]Mobilversion : http://da.swewe.net/wap
Ordforråd Søg
SWEWE Medlem :Logon |Registrering |Gratis at udgive ordforråd viden

Forrige 1 Næste Vælg sider

Agarosegelelektroforese

Agarosegelelektroforese med agar eller agarosegelelektroforese som en metode til understøttede medier. Molekylvægten af ​​prøven, såsom nukleinsyremolekyler, virus, etc., kan generelt være større porestørrelse separeret ved agarosegelelektroforese.

Princip

Agarosegelelektroforese blev anvendt som underlag elektroforese. Dens analytiske principper og andre understøtninger elektroforese væsentligste forskel er: den kombinerer de "molekylsigterne" og "elektroforese" dobbelt rolle. Agarosegel har et netværk struktur vil blive videregivet stof molekyler modstand makromolekyler, når modstanden i den kraftige stigning store, så gelelektroforese, afhænger ikke kun af adskillelsen af ​​de ladede partikler af arten og mængden af ​​netto-ladning, og afhænger også molekylære størrelse, som forbedrer evnen til at skelne. Men på grund af dets forholdsvis stor diameter, er størstedelen af ​​den molekylsigte effekt ubetydelig protein, nukleinsyrer almindeligt anvendt i undersøgelsen.

Proteiner og nukleinsyrer ifølge forskellige pH-værdier med forskellig ladning, kan det elektriske felt kraft i forskellige størrelser, så kører med forskellige hastigheder, efter dette princip kan adskilles. Elektroforese bufre pH-værdi mellem 6 og 9, ionstyrke 0,02-0,05 er den optimale. Anvendes en 1% agarosegelelektroforese som en støtte. Kan skelnes ved agarosegel væk omkring 100bp DNA-fragment, selvom opløsningen er lavere end polyacrylamidgeler, men det er let forberedelse, adskillelse rækkevidde. Standard agarosegel isoleret DNA i intervallet 0,2-20kb, brug af pulseret elektroforese, op til 10 ^ 7bp adskillelige DNA-fragment.

DNA-molekyler i agarosegelen når svømning effekt afgift virkning og molekylsigter. DNA-molekyler i den ovennævnte opløsning, pH af det isoelektriske punkt af den negativt ladede, bevæger sig mod den positive pol i et elektrisk felt. Da sukker - fosfat rygraden i den repetitive karakter af strukturen, det samme antal dobbeltstrenget DNA næsten samme mængde netto ladning, så de kan med samme hastighed til den positive retning.

Operationelle processer

Tilberedt med en ren ark og elektroforese tanken

Bemærk DNA enzym kontamineret udstyr kan nedbrydes DNA, hvilket resulterer i et svagt signal bands, fuzzy eller fraværende fænomen.

Elektroforese

Nukleinsyredetektion kræver generelt kun kan agarosegelelektroforese, høj opløsning elektroforese eventuelt især kun et par bp forskel bør vælges ved polyacrylamidgelelektroforese; enorme uhensigtsmæssig brug almindelig elektroforese DNA-kæden bør anvendes pulserende felt-gelelektroforese. Note kæmpe streng af DNA elektroforese kan løbe ikke med almindeligt plast hul bly mangler bælte.

Gelkoncentration

For agarosegelelektroforese, er koncentrationen sædvanligvis 0,5 til 2%, de lave koncentrationer anvendt til det store fragment af nukleinsyre elektroforese, at høje koncentrationer af små fragmenter analyseres. Lave koncentrationer af gummi skørt omhyggelig drift og brug god kvalitet agarose er en løsning. Bemærk, at høje koncentrationer af tyggegummi kan gøre en lignende molekylær størrelse DNA-bånd er ikke let at skelne, hvilket fraværende band fænomen.

Buffer

En TAE buffer, der bruges, og TBE, TAE og TBE har bedre end bufferkapacitet. Elektroforese buffer ved hjælp af det nye system kan forbedre elektroforese resultater. Bemærk, at gentagen brug elektroforese buffer, ionstyrke reduktion pH-værdi øges, stødabsorberende præstationer kan DNA elektroforese producere sløret og uregelmæssige bands DNA band migration fænomen.

Spænding og temperatur

Elektroforese spænding må ikke overstige 20V/cm bør elektroforese temperaturen være under 30 ℃, den enorme DNA elektroforese, skal temperaturen være under 15 ℃. Bemærk Hvis elektroforese spænding og temperaturen er for høj, kan det forårsage sløret og uregelmæssige striber DNA band migration fænomen. Især spænding for lille, kan føre til fremkomsten af ​​korte fragmenter løb tør for plast med et fænomen

Renhed og tilstand af DNA-prøven

Bemærk, at saltindholdet er for højt og prøven indeholdende urenheder kan producere proteinbånd var vage og fraværende band fænomen. Ethanolfældning kan fjerne overskydende salt, kan proteiner med phenol fjernes. Bemærk denatureret DNA prøver kan føre til uklarhed og manglende strimler kan også forekomme DNA-bånd af irregulær migration. Ikke til prøven før prøven opvarmes DNA, 20 mM NaCl med fortyndingsbuffer at forhindre denaturering af DNA.

DNA i prøven

Korrekt DNA-prøve volumen er stribede og klare garantier. Bemærk, at for megen DNA-prøve volumen kan føre til DNA båndmønster blur, og en DNA-prøve volumen er for lille, så det resulterende signal er svagt eller fraværende bånd.

Vælg Marker

Vær sikker på at bruge DNA elektroforese DNA-markør, eller positiv kontrol DNA med kendt størrelse, til at anslå størrelsen af ​​DNA-fragmenter. Marker bør vælge størrelsen af ​​målet fragment tættere nær stigen, så skøn over størrelsen af ​​målet fragmentet var mere nøjagtige. Bemærk, at det samme skal også overholde de elektroforese Marker DNA elektroforese drifts-standarder. Hvis du vælger XDNA / HindIII eller XDNA / EcoRI spaltning Marker, nødt til at forvarme 65 ℃ 5min, afkølet på is før brug. HindIII eller EcoRI-spaltning og derved undgå klæbrighed forårsaget af uregelmæssige samlinger resulterende fragment eller stribe signalet er svagt og så videre.

Gelfarvning og observation

Den nukleinsyre pletten er almindeligt anvendt laboratorium ethidiumbromid (EB), god farvning effekt, let at betjene, men dårlig stabilitet, som er giftigt. Overhold gelen bør baseres på forskellige farvestoffer med passende lyskilde og excitationsbølgelængde excitationsbølgelængde hvis ikke, strimlen er svært at observere, banding sløring.

Recover

DNA-fragment gel ekstraktion metode

Elektroforetisk elueringsmetode [1]

Lavt smeltepunkt agarosegelelektroforese at grave blok metode

Fryse-tø Recovery Act


Forrige 1 Næste Vælg sider
Ordforråd Søg

版权申明 | 隐私权政策 | Gratis at udgive ordforråd viden
Copyright @2014 Verden encyklopædiske viden