| Sprog : |
|
| Encyclopedia samfund |Encyclopedia Svar |Indsend spørgsmål |Ordforråd Viden |Upload viden |
Koncentreret gel |
|
Koncentreret gel SDS-PAGE: polyacrylamidgelelektroforese, for forskellig molekylvægt proteiner / adskillelse af oligonucleotider. Action Rollen af koncentreret gel stabling interaktioner, gelen koncentrationen er lille, stor blændeåbning, mere fortynde prøven tilsættes til den koncentrerede gel efter migrering af store porer gel effekt blev koncentreret til en smal zone. Når prøvevæsken og en koncentreret gel pH 6,8 udvælgelse af TRIS / HCI-buffer, elektrode opløsning valgt TRIS / glycin. Efter begyndelsen af elektroforese, HCL dissocieres til chloridion, glycin, glycin, en lille mængde af dissocierede ioner. Protein med en negativ ladning, sammen med bevægelsen til den positive, hvor den hurtigste chlorid, glycin ion langsomste protein centreret. Elektroforetisk mobilitet begynder chlorid den maksimale hastighed, mere end protein, hvorved der dannes en lav ledningsevne region i ryggen, og den elektriske feltstyrke er omvendt proportionalt med lav ledningsevne regionen, hvilket resulterer i en høj elektrisk feltstyrke, til proteinet bevæger sig hurtigt ioner og glycin, danner en stabil grænseflade, protein aggregater i nærheden af grænsefladen bevæger sig, koncentreret i et mellemliggende lag. Elektroforese væsentligt forbedret følsomhed.Metode til forberedelse Generelt isozym vælge 7? 5% til 10% af tyggegummiet (7 peroxidase og esterase? 5% mere hensigtsmæssigt, SOD med 10%, kan opløseligt protein fremstilles efter behov). Indstil den forberedte flydende gel vakuum tørretumbler, udstødning 10Min, derefter tilføje TEMED15μl, bland med et tyndt glas stang dræning riller langs uden glasplade injiceres langsomt plastik kammer for at forhindre udleveringen processen bobler. 3CM påføres lim på langt fra rillen, sprøjten forsigtigt umiddelbart over opløsningen i gelen lag af vand spredes 1cm høj, men ikke forstyrrer overflade acrylamidgel. Gel, der skal adskilles, og det vandige lag, når grænsefladen mellem klar, at polymerisationen er afsluttet. Omhyggeligt indsugning med en sprøjte øverste dæksel vand, god forberedelse i henhold til tabel 5-1 stabelgel, udstødning efter tilsætning 5μlTEMED, blandes og tilsættes til den øvre gel, indsætte forudvalgt prøve kam, være forsigtig med ikke at bringe luftbobler. Forberedelse tabel Kategori separationsgel stabelgel T% 57.51012.51517.520330% Acr5.07.39.7512.3214.8817.420.011% Bis45.67.55.43.53.531 adskillelse gelpuffer 3.753.753.753.753.753.753.75-stacking gel buffer ------- 2.5 redestilleret vand 17.0513.158.88.337.675.153.055.4310% AP0.20.20.20.20.20.20.20.07 Note: gel 30ml, stabelgel 10ML, i henhold til behovene i de enkelte komponenter proportionalt øge eller mindske lydstyrken. Operation Prøveforberedelse indsamlet på antallet af først udvid hvede sætteplante blade, tage midten, fjerne venerne, nøjagtigt afvejet 1g, tilsættes en lille mængde til at nævne prøvebuffer, homogeniseret slibning isbad sæt volumen til 5 ml, 10000r/Min centrifugale 15Min på Serum opløseligt protein råekstrakter. Denne opløsning kontrolleres 0? 5ml tilsætning af et lige volumen prøve forarbejdning løsning, blandes opbevares i køleskab til brug. (1) vil blive fanget i den forberedte gelelektroforese tanken om bord til bunden slot indsprøjtning elektrode buffer, prøven kam fjerne (være omhyggelig med ikke at trække fra den slags groove vægge). Mikro-injektor nålen ind den slags rillebunden langsomt injektioner pr slot spotting 15 ~ 20 ul. (2) på tanken, så negative, så positive næste slot, tænd blev den nuværende justeres til 15 ~ 20mA, spænding er 200V, elektroforese, indtil bromphenolblåt skiltene til gel foran indtil strøm og spænding til nul efter strømsvigt . (3) Efter elektroforese fjerne glaspladen, iturevne tape, ude af clamp bands, indstille de to glasplader under vandhanen, med vand, ved hjælp af en dissekere kniv håndtag forsigtigt lirke fra pladen side af sutural glasplade (bemærk aldrig lirke fra rillen), gelen ind farvningsopløsningen. (A) peroxidasefarvning afvejes 0? 1g benzidin, plus en lille mængde vandfri ethanol blev tilsat 5Mol/LHAC10Ml, 1.? 5Mol/LNAAC10Ml, H2O70Ml endelig tilsætte 3 til 5 dråber H2O2. Denne farve væske hældes i en petriskål 20CM, tilføjes efter at være gelelektroforese chip under konstant omrøring, observere farven på hvert bånd har, fotografiske, eller bruge en blyant til at tegne peroxidase isoenzymer. Endelig 7% eddikesyre fast (bemærke, at båndet er let at falme i HAC opløsning, fast tid ikke for lang), fremstillet af tør film foto eller gemme resultatet. (2) Afvej chromogene esterase isozymerne 50Mgα-naphthylacetat, 50Mgβ-naphthylacetat, 100mg Fast Blue RR (eller Fast Blue B), først med ca 5ml opløst i acetone, og derefter 0? 1Mol / LPH5? 0 phosphatpufferopløsning til 150ml, 100ml arket blev nedsænket i denne opløsning ved stuetemperatur, farven på ca 20min, kan du se de lyserøde zone phosphatase-isoenzymer. Farveopløsning blev kasseret, skyllet med destilleret vand, derefter 7% HAC fast. (3) superoxiddismutase farvestof plet sammensætning: nitro blå tetrazolium (NBT) 25μMol / L, riboflavin 0 01%; 50MMol/LPH7 8 phosphatpufferopløsning (indeholdende 1MMol/LEDTA)?. Farvning elektroforese ark i den klargjorte opløsning indeholdende 80MlNBT (ark størrelse efter mængden af addition og subtraktion opløsning) i en petriskål, sættetid 15Min, konvertering af riboflavin løsning sættetid 5Min, derefter anbragt i plastfolie, der indeholder 1MMol/LEDTA i PH7? 8 phosphatbuffer i en afstand med en 40W fluorescerende plade 10CM højde direkte klæbende overflade, indtil den blå baggrund forekommer transparente bånd hidtil. (4) hydrogenperoxid farvning farvestof sammensætning isozymer:?? En opløsning af 3% H2O225Ml, 0 1Mol/LPH7 0 phosphatpuffer 5ml, 0 1Mol/LNA2S2O33 5ml, B-opløsning som 0 09Mol /? LKI25Ml destilleret vand 25ml. Første forberedt elektroforese Et ark dyppet i flydende ved stuetemperatur i 15 min, hæld løsning A, skylles grundigt med destilleret vand, tilsæt flydende B, enzymaktivitet udtrykt i hvidt på en blå baggrund zone. Efter skylning med destilleret vand, fikseret 10% glycerol. (5) afvejes opløseligt protein farvning 0? 2g Coomassie brilliant blue R250, opløst i en lille mængde ethanol, indeholdende 40% ethanol og 7% eddikesyre vandig opløsning blev fortyndet til 200 ml. Vil blive nedsænket i denne opløsning ved stuetemperatur ark farves 5 ~ 6H, smidt væk pletten, skylles farvestof bundet til plastoverfladen, og derefter nedsænket i blegende gel opløsning (400 ml ethanol, 70ml iseddike, tilsæt vand til 1000 ml) udskiftning Affarvningsopløsningen flere gange indtil en klar baggrund hidtil. (6) Resultaterne vil blive gemt væk kamera eller off farve geler efter scanning lab rapport som bevismateriale. Som studerende lab rapport tilgængelig metode til udarbejdelse eller gøre optegnelser selvklæbende bånd eller opløseligt protein enzym vigtigste bands eller gemme resultatet med en tør film. Som følger: Klæbende Forberedelse: skåret ud to langsider ca 3CM end film cellofan dyppet i vand, den første flise på glas, satte gelskiverne, og derefter dækket med et andet, med et glas stang til at fange Gåture boble cellofan ud til glasplade på den nederste kant med en anden af samme størrelse presset glas, og derefter klemme begge ender fast ved stuetemperatur i mørke i 1 dag eller så du kan derefter fjerne limen, trim pænt holdes. Tegning sagde: enzym med hvert bånd diagram tegnet af farvenuancer. Bemærk 1.SOD isoenzym elektroforese, bør gelen koncentrationen vælges 10% prøveekstrakt med 50MMol/LPH7? 8 phosphatpufferopløsning er ideel. 2.ACr og bis er nervekampmidler og har en stimulerende effekt på huden. Udarbejdelse af flydende lagring med plast, plastic kunstvanding operation, til at bære medicinsk latex handsker eller finger barnesenge, undgå kontakt med huden. Så længe omhyggelig betjening, generelt ikke forårsage skader. 3? ACR og bis oprensning. Præcis kvantitativ analyse og præparativ elektroforese kræver højere renhed ACR og BIS, rensningsmetode er som følger: (1) ACR omkrystallisation ACR 50 ℃ opløst i chloroform (70 g / L), filtreret varm, og filtratet blev afkølet til -20 ℃, krystallisation. Buchner-tragt med kold filtrering blev krystallerne opsamlet? Skyllet med kold chloroform og tørret under vakuum. Smeltepunktet af ren ACR 84? 5 ± 0? 3 ℃. (2) Bis omkrystallisation 12gBIs 1000Ml40 ~ 50 ℃ opløst i acetone, filtreret varm, og filtratet blev gradvist afkølet til 20 ℃, en Buchner-tragt med kold filtrering blev krystallerne opsamlet. Skyllet med kold acetone og tørret i vakuum. Smeltepunktet af ren Bis 185 ℃. |
| Bruger Anmeldelse |
|
Ingen kommentarer endnu |
