| Sprog : |
|
| Encyclopedia samfund |Encyclopedia Svar |Indsend spørgsmål |Ordforråd Viden |Upload viden |
In situ-hybridisering |
 |
|
In situ-hybridisering henviser til det specifikke mærkede nukleinsyreprobe af kendt sekvens af celler eller vævssnit og nukleinsyrehybridisering, og dermed præcis kvantificering af specifik nukleinsyresekvens til positionering processen. In situ-hybridisering i celleprøver fortsætte eller vævsprøver. En anden fluorescens in situ hybridisering. Grundlæggende definitioner In situ-hybridisering (in situ hybridisering) den mærkede nukleinsyreprobe og nukleinsyre i celler eller væv blev hybridiseret in situ kaldet hybridisering!Anvendelse af DNA eller RNA-probe til påvisning komplementær til den anden streng i en bakterie eller andre eukaryote celler i position. RNA in situ hybridisering, også kendt som RNA in situ hybridisering histokemi eller RNA in situ hybridisering. Teknologien er brugen af cRNA eller oligonukleotidprobe til påvisning sådan RNA-ekspression i celler og væv in situ hybridisering teknik en. Det grundlæggende princip er: i en celle eller væv struktur forbliver de samme betingelser, med mærkede RNA med kendt nucleotidfragment, nukleinsyrehybridisering ifølge princippet om baseparring, og test-celler eller væv med de tilsvarende genfragmenter binding (hybridisering), den resulterende hybrid (Hybrider) farvereaktion ved den optiske mikroskop eller et elektronmikroskop at observere celle tilsvarende mRNA, rRNA og tRNA-molekyler. RNA in situ hybridisering teknikker gennem løbende forbedringer, har anvendelsesområdet været langt ud over DNA in situ hybridisering. Især i genetisk analyse og diagnosticering kan gøre kvalitativ og kvantitativ analyse af positionering, er blevet den mest effektive molekylære patologi teknologi, mens der i analysen af lav tæthed mRNA ekspression og sjældne aspekter af molekylær biologi har vist en vigtig retning. FISH in situ hybridisering af en stor familie, fordi sonden anvendes i fluorescensmærket (direkte eller indirekte) navn blev metoden opfundet i slutningen af 1980'erne, er nu gradvist fra laboratoriet til klinisk diagnostik . Det grundlæggende princip er den fluorescerende-mærket nukleinsyreprobe med de denaturerede målnukleinsyrer er denatureret genfoldning annealing temperatur fluorescenssignal blev observeret ved fluorescensmikroskopi kan analyseres uden at ændre objektet (dvs. at bevare sin position) til målet under den forudsætning nukleinsyren til analyse. Mærkede fluorescerende DNA-sonder er den mest almindelige type af nukleinsyreprobe. Med denne probe kan være på væv, celler eller kromosomalt DNA i kromosomet og genniveau analyse. Fluorescensmærkede kontrol pin ikke forurener miljøet, følsomheden kan beskyttes, kan være flerfarvet observation og analyse, som samtidig kan bruge flere sonder, brugte sonder separat forkortet på grund af en enkelt årsag cyklus-processen og tekniske forhindringer. Eksempel Ved kolonihybridisering som et eksempel: I en række af spredte par kolonier på agarplader (100-200) klon screening, kan fremgangsmåden anvendes. Disse kolonier blev integreret i en primær agarplade, og pladen er blevet placeret på agaroverfladen af et andet stykke af nitrocellulosefilter. Efter en inkubationstid tid. Kolonierne in situ lysis Vigtigste plade skal opbevares ved 4 ℃ indtil et filter resultater. De få kolonier blev overført til nitrocellulose (A) i agarplader indeholdende selektive antibiotika sat på en nitrocellulosemembran. (2) individuelle kolonier med en steril tandstik til at blive overført til filteret, overførsel til membranen indeholdende det selektive antibiotikum agar men sætte den primære plade. Bør stribet bestemte gitter (eller RBI). Hver koloni på de to plader er krydset for at være i den samme position. Endelig, i membranen og den vigtigste plade samtidig tegne et rekombinant plasmid indeholdende et ikke-(fx pBR322) kolonier. (3) omvendt tallerken, krydsede ved 37 ℃ for bakteriekolonier at vokse til en bredde på 0,5-1.0mm. (4) er blevet fyldt med vandtæt sort tegning blæk kanylen gennem membranen, indtil agar i tre eller flere asymmetrisk position mærket. Den vigtigste plade er også væsentligt samme position som mærket. (5) forseglet med Parafilm membran vigtigste plade, omvendt opbevaring er ved 4 ℃, indtil du får resultatet af hybridiseringsreaktionen. (6) bakteriel lysis, ifølge fremgangsmåden beskrevet nedenfor i dette afsnit, frigivelse af DNA bundet til nitrocellulosefilteret. Koloni lysis og DNA-binding til nitrocellulose (1) fremstilling af en film på en plast med 0,5 mol / l NaOH lille depression (0,75 ml), kolonien opad, blev filteret anbragt på en lille depression, fladtrykt plastfolie, således at en ensartet filter fugtige, lad membraner forblive på plads i 2-3 minutter. (2) med en tør papirserviet tørt filter fra bunden af filteret, ved hjælp af en ny plastfolie og en ny fremstilling af 0,5 mol / l NaOH gentagelse af trin (1). (3) tørt filter, blev filteret overført til et nyt med 1mol / L Tris · Cl (pH 7,4) liggende på plastfolie. Efter 5 minutter tørre filter, skal du gentage dette trin. (4) tør membran, overføre det til en 1,5 mol / l NaCl, 0,5 mol / L Tris-CI (pH 7,4) en lille fordybning på den plastfolie efter 5 minutter tør filter og overføres til en tør filtrerpapir, ved stuetemperatur i 20-30 minutter, blev membranen tørret. (5) filterpapir klemt inde mellem to tørret i en vakuumovn ved 80 ℃ tør ristet i 2 timer, fast DNA. (6) fastgjort på membranen 32P-mærket DNA og RNA hybridisering. 3 Hybrid (1) indeholdende 2 x SSC plast skål med tørre ristede membran flyder i væskeoverfladen, grundigt gennemvædet i 5 minutter. (2) vask af membranen til at pre 200ml glas fad. Han membraner stablet sammen, satte i opløsningen. Dæk glasfad med plastfolie og sættes i inkubatoren på en roterende platform. For 30 minutter ved 50 ℃. I dette trin og alle efterfølgende trin, der langsomt ryste membranen, for at forhindre dem i at klæbe sammen. (3) pre-gennemblødt absorberende bomuld lotion forsigtigt tørre overfladen af bakterierne fra membranfragmenter reducere baggrunden uden at påvirke hybridisering positivt hybridisering signalstyrke og klarhed. (4) membranen til præ-hybridiseringsopløsning indeholdende 150ml af glas, ved en passende temperatur (dvs. hybridisering i en vandig opløsning med 68 ℃, og i 50% formamid hybridisering med 42 ℃), præ-hybridiserede 1 - 2 timer. (5) den dobbeltstrengede DNA mærket med 32P-probe opvarmes ved 100 ℃ i 5 minutter, hurtigt placeret i et isbad. Single-prober uden degeneration. Tilsat til proben hybridiserede hybridisering natten taske. Under hybridisering, bør genlukkelige beholdere fyldes membran for at forhindre fordampning af væske. (6) Efter hybridisering fjernes hybridiseringsopløsning, membranen straks ved stuetemperatur i et stort volumen (300-500ml) 2 x SSC og 0,1% SDS-opløsning, og ryst forsigtigt i 5 minutter og mindst en flip filter gang. Gentag vask bør tør film også undgås. (7) 68 ℃ med 300-500ml 1 x SSC og 0,1% SDS-opløsning, blev membranerne vasket to gange, hver gang 1-1,5 timer. På dette tidspunkt kan underkastes autoradiografi. Eller eksperimentelle krav, såsom høj baggrund strenge membran vask, kan være 300-500ml 0,2 x SSC og 0,1% SDS-opløsning ved 68 ℃ filteret blev gennemvædet i 60 minutter. |
| Bruger Anmeldelse |
|
Ingen kommentarer endnu |
